Nature Communications最新研究成果：ZNF683⁺ NK细胞通过重塑免疫微环境调控晚期下咽鳞状细胞癌的化疗敏感性

本研究通过纵向单细胞测序，揭示了下咽鳞状细胞癌（HPSCC）对TPF化疗敏感性的关键免疫机制：肿瘤基线浸润的ZNF683⁺自然杀伤（NK）细胞，通过MHC-I依赖的细胞间直接接触，驱动CD8⁺效应记忆T细胞向多功能、低耗竭的GZMK⁺状态极化并扩增，从而成为化疗疗效的“守门人”；该发现不仅证明ZNF683⁺NK细胞可作为预测化疗应答的有效生物标志物，也为通过靶向NK-T细胞免疫轴来克服化疗耐药提供了新策略。

《Nature Communications》（简称 “Nat Commun”）是自然科研（Nature Research）旗下的国际顶级开放获取（Open Access）综合性学术期刊，2010年正式创刊，旨在发表自然科学领域（涵盖生物、化学、物理、地球科学、医学等）具有重要科学意义、但未达到《Nature》主刊突破性高度的原创研究成果，填补了顶级主刊与专业子刊间的发表空白。

出版周期：Weekly；

影响因子：2024-2025最新影响因子为15.7，五年影响因子为17.2；

ISSN：2041-1723；

发文量：2024 年发文量为10749篇；

版面费：$6790.00/篇；

一、研究背景

下咽鳞状细胞癌（HPSCC） 作为头颈癌中预后最差的亚型之一，因解剖位置隐匿，多数患者确诊时已处于晚期，其5年生存率仅为25%-35%。目前，TPF方案（多西他赛+顺铂+5-氟尿嘧啶） 是其标准一线诱导化疗，但临床上约有10-20%的患者存在先天性耐药，不仅无效还延误了其他治疗时机，然而其耐药的根本免疫学机制尚不清楚。其次，尽管此前研究利用基因组学初步探索了头颈癌耐药特征，但常规转录组测序（Bulk RNA-seq）只能反映细胞群体的平均表达水平，无法区分肿瘤细胞与微环境中复杂的免疫细胞亚群，更缺乏专门针对HPSCC这一特定亚型、且涵盖化疗前后配对样本的纵向单细胞尺度分析。因此，亟需通过高分辨率的单细胞转录组技术，系统绘制化疗过程中肿瘤免疫微环境的动态演变图谱，以期发掘能够预测化疗应答的有效生物标志物，并阐明先天耐药的免疫逃逸机制，从而为筛选受益人群及设计克服耐药的联合免疫治疗策略提供理论依据。

二、关键技术总结

单细胞转录组测序与免疫图谱构建

研究采用10x Genomics单细胞免疫组库技术，对下咽鳞状细胞癌（HPSCC）患者接受TPF化疗前后的肿瘤样本进行纵向单细胞RNA测序，首次在单细胞分辨率下描绘了化疗驱动的免疫微环境动态图谱。通过UMAP降维、伪时间轨迹分析和差异基因表达分析，研究从157,019个CD45+免疫细胞中识别出9个主要亚群，并发现基线ZNF683+ NK细胞在化疗敏感者中显著富集，其浸润比例与肿瘤退缩率呈正相关（R=0.616）。该技术突破了传统bulk测序无法区分细胞异质性的局限，揭示了NK细胞而非其他免疫亚群是决定TPF疗效的关键免疫组分，为后续机制研究提供了精准的细胞靶向基础。

多重免疫组化与空间定位验证

研究运用酪胺信号放大技术的多重荧光免疫组化，在组织切片上同时标记CD56、ZNF683、CD8、GZMK、PD-1及pan-cytokeratin等多种标志物，实现了对目标免疫细胞的空间可视化与半定量分析。该方法确认ZNF683+ NK细胞主要分布于肿瘤间质区，且在化疗敏感组中密度显著高于非敏感组。同时，通过表面标志物CX3CR1和KIT的筛选，研究确立了CX3CR1⁻KIT⁻表型作为ZNF683+ NK细胞的替代分选策略，解决了ZNF683作为核转录因子无法通过流式直接检测的难题。该技术桥接了单细胞转录组数据与组织原位信息，为生物标志物的临床转化提供了可靠的空间证据。

体外共培养与体内基因敲除的功能验证

研究建立了两大功能验证体系。体外实验中，将分选的ZNF683+ NK细胞（CX3CR1⁻KIT⁻）与自体CD8+ T细胞共培养，发现直接接触可显著促进PD-1^mid GZMK+ CD8+ T细胞扩增，而Transwell隔离或MHC-I抗体阻断则消除该效应，证实其依赖MHC-I/CD8介导的物理接触。体内研究中，团队构建了ZNF683条件性敲除小鼠（Znf683^(flox/flox) Ncr^(Cre)），特异性敲除NK细胞中的ZNF683后，NK细胞MHC-I表达显著下降，且失去刺激CD8+ T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力。此外，小鼠肿瘤模型显示NK细胞耗竭可完全消除TPF化疗的抗肿瘤效果，从功能学上确立了ZNF683+ NK-GZMK+ CD8+ T轴作为化疗敏感性的核心执行通路。

三、主要研究成果

1、研究设计与实验框架

图1、研究设计与实验框架

研究分为发现队列（Discovery cohort）和验证队列（Validation cohort）。发现队列纳入2020年1月至2022年12月期间接受两个周期TPF（多西他赛+顺铂+5-氟尿嘧啶）化疗的12例HPSCC患者，在化疗前后分别采集配对原发肿瘤样本，用于单细胞RNA测序和RNA-seq分析。验证队列纳入2023年1月至2025年4月期间的41例患者，提供配对或非配对肿瘤样本，用于多重免疫组化（mIHC）和流式细胞术（FACS）验证。根据实体瘤疗效评价标准（RECIST 1.1指南），通过增强MRI测量化疗前及第二周期化疗后4周的肿瘤直径变化，计算肿瘤退缩率（TSR）。患者分为四组：完全缓解（CR，靶病灶全部消失）、部分缓解（PR，靶病灶直径总和减少≥30%）、疾病进展（PD，靶病灶直径总和增加≥20%）和疾病稳定（SD，介于PR与PD之间）。后续免疫浸润分析中，将CR和PR患者合并为应答者（Rs，7例），将PD和SD患者合并为非应答者（NRs，5例）。两组患者在年龄、饮酒史、吸烟史、临床分期、病理分级及原发灶部位等临床变量上无显著差异。随后，通过FACS分选活CD45+免疫细胞进行10x Genomics单细胞免疫组库测序，获取157,019个细胞的转录组数据；同时结合bulk RNA-seq进行PCA和GSVA分析；利用mIHC实现组织原位空间验证；并通过体外共培养实验和小鼠MEER肿瘤模型（含NK细胞清除和ZNF683条件性敲除）进行功能机制验证。

2、HPSCC免疫浸润景观

单细胞测序结果共呈现了157,019个CD45+免疫细胞的单细胞转录组UMAP降维可视化，共鉴定出9个主要免疫细胞亚群，包括髓系来源细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞）和淋巴系细胞（T细胞、B细胞、浆细胞、NK细胞）。通过典型标志物基因表达热图验证了各亚群的身份注释。UMAP投影显示细胞未按患者来源、化疗前后或治疗应答状态产生批次效应，保证了数据整合的可靠性。然而，各患者间免疫组成存在显著异质性，提示需要深入挖掘与化疗敏感性相关的关键免疫亚群。这为后续识别NK细胞作为化疗敏感性决定因素奠定了单细胞水平的全景式免疫图谱基础。

图2、HPSCC免疫浸润景观

3、NK细胞浸润决定TPF化疗疗效

研究发现，HPSCC肿瘤组织中免疫细胞浸润率为71.86±23.96%，共鉴定出9个免疫亚群。比较分析显示，化疗前应答者（Rs）的NK细胞浸润比例显著高于非应答者（NRs），而其余8种免疫亚群在两组间均无差异。基线NK细胞频率与肿瘤退缩率呈正相关（R=0.616），但化疗后两组免疫谱无差异，提示基线NK细胞是TPF化疗敏感性的潜在预测指标。流式细胞术（CD45⁺CD3⁻CD56⁺）和mIHC在独立验证队列中进一步确认，应答者呈现弥漫性间质主导的NK细胞浸润模式，而非应答者则表现为稀疏分布，从蛋白层面验证了单细胞测序的发现。为明确NK细胞的功能必要性，研究建立C57BL/6小鼠MEER同源肿瘤模型，分为对照组、NK清除组（抗NK1.1）、TPF单药组及TPF联合抗NK1.1组。结果显示，抗NK1.1有效清除NK细胞且不影响小鼠体重。TPF化疗显著抑制肿瘤生长，但联合NK清除后TPF的抗肿瘤效果几乎完全消失，肿瘤体积和重量均显著增加。该体内功能实验直接证明，NK细胞活性是TPF化疗发挥疗效不可或缺的决定因素，而非仅仅作为相关性标志物。

图3、NK细胞浸润决定治疗应答

4、NK细胞亚型预测化疗应答

为深入解析NK细胞的异质性，研究对7,539个NK细胞进行单细胞转录组分析，基于经典标志基因鉴定出三个功能各异的亚群：NK1（ZNF683⁺）、NK2（CX3CR1⁺）和NK3（KIT⁺）。所有亚群均表达NK特征基因（如GNLY、NKG7），RNA速度分析提示NK1向NK2存在潜在发育轨迹。定量分析显示，NK1细胞在应答者中显著富集，而NK2和NK3亚群在应答者与非应答者间无差异；其他免疫细胞亚群（CD4⁺/CD8⁺ T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞）同样未见组间差异。PCA分析显示应答者与非应答者化疗前的转录组存在显著分离。进一步基于差异表达基因构建特征评分，确认NK1亚群评分在应答者中显著升高。TCGA数据库分析表明，NK/NK1特征评分与HNSCC患者较好预后显著相关，而NK2/NK3评分无此关联。以上结果共同确立了基线ZNF683⁺ NK1细胞浸润作为TPF化疗敏感性预测因子的核心地位，且这种预测能力具有NK1亚群特异性。

图4、NK细胞亚型预测化疗应答

5、ZNF683⁺ NK细胞的临床价值

为将单细胞发现转化为临床可应用的检测方案，研究通过mIHC对HPSCC组织中ZNF683⁺ NK细胞进行空间定位和定量分析。结果显示，ZNF683⁺ NK细胞主要分布于肿瘤间质区，偶见于瘤巢内，在化疗敏感组中呈现更高的细胞密度和荧光强度。定量分析确认应答者中ZNF683⁺ NK细胞密度显著高于非应答者（p<0.001），且差异主要来源于间质区域而非瘤巢内部，建立了其预测TPF敏感性的临床价值。鉴于ZNF683为核转录因子无法通过流式细胞术直接检测，研究者通过mIHC表面标志物筛选发现ZNF683⁺ NK细胞不表达CX3CR1或KIT（CD117），提示CX3CR1（NK2）和KIT（NK3）可作为亚型特异性表面标志物。流式细胞术成功将HPSCC NK细胞分为CX3CR1⁺、KIT⁺及CX3CR1⁻KIT⁻双阴性三群，后续RNA和蛋白定量证实ZNF683仅富集于CX3CR1⁻KIT⁻细胞中，由此定义了该表型为ZNF683⁺ NK富集细胞。临床分析显示，CX3CR1⁻KIT⁻细胞在应答者中显著富集，而CX3CR1⁺或KIT⁺亚群无组间差异，成功建立了基于表面标志物的ZNF683⁺ NK细胞临床检测策略，为前瞻性患者筛选提供了可行工具。

图5、ZNF683⁺ NK细胞的临床价值

6、ZNF683+ NK细胞促进T细胞免疫应答

为解析ZNF683⁺ NK细胞的功能特征，研究首先对三种NK亚型进行GO和KEGG通路富集分析。结果显示，ZNF683⁺ NK细胞（NK1）特异性富集于T细胞活化与招募相关通路（如“α-β T细胞活化调控”、“淋巴细胞活化参与免疫应答”、“T细胞趋化”及“细胞因子-细胞因子受体互作”），而NK2（CX3CR1⁺）富集于细胞毒性通路（如“细胞杀伤”、“NK细胞介导的细胞毒性”），NK3（KIT⁺）则富集于前体样增殖分化通路。UMAP通路活性评分进一步验证了各亚型的功能专一性，表明ZNF683⁺ NK细胞主要通过调控T细胞而非直接杀伤肿瘤来发挥作用。

为明确ZNF683⁺ NK细胞调控的具体T细胞靶群，研究将T细胞进一步分为15个亚群（7个CD4⁺、8个CD8⁺），并聚焦于TCR克隆扩增分析（鉴于东南亚HPV相关HPSCC低流行）。结果显示，化疗后应答者中高度扩增T细胞克隆（扩增倍数≥4）的比例显著高于非应答者；纵向比较表明，仅在应答者中，化疗后高度扩增克隆比例较化疗前显著上升，非应答者中无此变化。该结果揭示了ZNF683⁺ NK细胞通过招募和促进T细胞克隆扩增参与抗肿瘤免疫应答，为理解其在化疗敏感性中的非经典功能提供了机制线索。

7、GZMK⁺CD8⁺ T细胞介导TPF化疗应答

图7、GZMK⁺CD8⁺ T细胞介导TPF化疗应答

为明确介导化疗敏感性的具体T细胞效应群体，研究对CD8⁺ T细胞亚群进行深入分析，检测了干细胞性（SLAMF6/TCF7）、细胞毒性（GZMB/IFNG/TNF）和耗竭（HAVCR2/LAG3/PDCD1）标志物的表达。结果显示，GZMK⁺CD8⁺效应记忆T细胞（T_EM） 独特地共表达细胞毒性分子TNF和IFN-γ（双阳性频率显著高于GZMK⁻细胞），同时低表达耗竭标志物，且表达干细胞样标志物SLAMF6和TCF7，呈现多功能抗肿瘤效应表型兼具干性维持能力的双峰组成。进一步流式分析确认，PD-1⁺GZMK⁺CD8⁺ T细胞为CCR7⁻CD45RA⁻的T_EM表型，且PD-1中等表达细胞GZMK水平高于PD-1高表达亚群。mIHC追踪显示，化疗后应答者中PD-1⁺GZMK⁺CD8⁺ T细胞（黄色）显著增加，主要位于间质区域，而非应答者中无此变化。小鼠肿瘤模型证实，TPF治疗显著提升PD-1^mid CD8⁺ T细胞中TNF⁺IFN⁺细胞比例（主要由CD62L⁻CD69⁺效应记忆表型构成），该效应在联合抗NK1.1清除NK细胞后被完全消除，而PD-1^low或PD-1^high CD8⁺亚群无变化。以上结果确立了GZMK⁺CD8⁺ T_EM细胞为TPF化疗应答的核心T细胞效应群体，且其扩增严格依赖于NK细胞的参与。

8、ZNF683⁺ NK与CD8⁺ T细胞通过MHC-I介导的crosstalk

为阐明ZNF683⁺ NK细胞驱动GZMK⁺CD8⁺ T细胞分化的分子机制，研究者开展了一系列体外和体内功能实验。首先，从HPSCC组织中分选ZNF683⁻ NK（CX3CR1⁺/KIT⁺）和ZNF683⁺ NK（CX3CR1⁻KIT⁻）细胞，与自体外周血CD8⁺ T细胞在接触式和Transwell条件下共培养。结果显示，直接接触共培养显著增加PD-1^mid GZMK⁺CD8⁺ T细胞的增殖，而Transwell隔离完全消除此效应，证实两者间的对话为接触依赖性。生物信息学CellChat分析预测ZNF683⁺ NK与GZMK⁺CD8⁺ T细胞间存在强相互作用信号，其中MHC-I介导的通路（HLA-A/B/C-CD8A/B结合）占主导地位。进一步使用MHC-I抗体（抗HLA-ABC）阻断后，PD-1^mid GZMK⁺CD8⁺ T细胞的扩增被完全消除。为在体内验证ZNF683的关键作用，研究者构建了ZNF683条件性敲除小鼠（Znf683^(flox/flox) Ncr^(Cre)），在NK细胞中特异性敲除ZNF683。结果显示，ZNF683缺陷的NK细胞MHC-I表达显著降低，且与CD8⁺ T细胞共培养时促进CD8⁺ T细胞活化（PD-1表达升高）及分泌IFN-γ和TNF-α的能力明显减弱。综上，该部分确立了ZNF683⁺ NK细胞通过MHC-I/CD8依赖的物理接触驱动多功能GZMK⁺CD8⁺效应T细胞分化的完整机制通路，揭示了ZNF683作为转录因子调控NK细胞MHC-I表达进而影响T细胞功能的关键分子轴。

图8、ZNF683+ NK与CD8+ T细胞通过MHC-I介导的crosstalk

四、研究的意义及不足

该研究通过纵向单细胞转录组测序、空间多重免疫组化及体内外功能验证，首次在下咽鳞状细胞癌中揭示了ZNF683⁺ NK细胞作为TPF化疗敏感性的核心地位， NK细胞的存在与否直接决定了T细胞抗肿瘤应答能否被有效启动，并阐明了其通过MHC-I/CD8依赖的物理接触驱动GZMK⁺CD8⁺效应记忆T细胞分化的免疫机制，打破了以细胞毒性为核心的NK细胞功能认知范式。研究建立了CX3CR1⁻KIT⁻作为ZNF683⁺ NK细胞的替代表面标志物检测方案，为临床前瞻性筛选化疗敏感患者提供了可行工具，同时提出NK-T细胞免疫轴可作为克服化疗耐药的潜在治疗靶点，具有明确的转化医学价值。

然而，研究也存在一些不足之处 首先，体外共培养实验中因活检肿瘤组织CD8⁺ T细胞数量不足，研究者使用同一患者外周血CD8⁺ T细胞替代，未能完全模拟肿瘤微环境中T细胞的状态。其次，ZNF683⁺ NK细胞如何特异性招募GZMK⁺ T细胞共定位的趋化机制尚不明确，是否存在中间细胞类型介导仍需探索。第三，非应答者中NK细胞浸润减少的机制尚不明确，可能涉及TGF-β等免疫抑制因子、癌相关成纤维细胞（CAF）构成的物理屏障或趋化因子配体表达不足等，但本研究未对此进行深入解析，有待后续探究。此外，样本量相对有限，部分应答者中NK细胞评分较低且与部分缓解组接近临界值，提示预测阈值需在大规模前瞻性队列中进一步验证。最后，NK细胞与T细胞之间超微结构特殊化（如突触膜延伸）如何增强MHC-I介导的信号传导效率，仍需更高分辨率的成像研究加以阐明。

参考文献：

Li, G., Xiao, W., Wu, H. et al. ZNF683+ NK cells govern chemotherapy sensitivity in advanced HPSCC via reshaping immune microenvironment. Nat Commun 17, 2069 (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-68676-x