肝癌细胞如何"铜墙铁壁"抵抗死亡？HBV蛋白X破解线粒体铜代谢密码

肝癌细胞如何"铜墙铁壁"抵抗死亡？HBV蛋白X破解线粒体铜代谢密码

一、研究背景

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共卫生问题，约有2.96亿人处于慢性感染状态，HBV相关肝细胞癌（HCC）每年导致超过80万人死亡。HBV编码的X蛋白（HBx）通过重塑宿主转录和信号网络、调控多种程序性细胞死亡（如凋亡、铁死亡、坏死性凋亡、焦亡等）促进恶性进展和治疗抵抗。

铜死亡（Cuproptosis）是2022年Tsvetkov等人新近定义的一种铜依赖的、以线粒体为中心的调控性细胞死亡形式，其特征是铜离子与脂酰化的三羧酸（TCA）循环蛋白结合，引发毒性聚集并破坏铁硫簇，选择性杀伤线粒体呼吸依赖型细胞。铜离子载体（如elesclomol, ES）可升高线粒体铜水平触发铜死亡，而铜螯合剂（如四硫代钼酸盐, TTM）则拮抗此过程。然而，HBV是否通过HBx干扰铜稳态和铜死亡以促进肝细胞癌发生发展，此前尚不清楚。

STEAP4（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4）是一种NADPH依赖的金属还原酶，可将Cu²⁺/Fe³⁺还原为Cu⁺/Fe²⁺，在STEAP家族中具有最高的金属摄取活性，是铜代谢和铜死亡敏感性的关键调控因子。临床研究表明STEAP4在HCC中广泛下调，且与晚期分期和不良预后相关。鉴于HBV感染患者血清铜水平升高，以及STEAP4在铜稳态中的核心作用，本研究旨在阐明HBx是否通过调控STEAP4介导铜死亡逃逸，并探索靶向该通路的潜在治疗策略。

二、研究内容概述

1. STEAP4介导的铜代谢和铜死亡定义了HBV相关HCC的治疗脆弱性

研究团队整合GEO（GSE62232、GSE135631、GSE121248、GSE94660）、TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP和CPTAC等多个公共数据库，对127个铜代谢基因和10个核心铜死亡调控因子进行差异表达分析和基因集富集分析（GSEA）。结果显示，HBV阳性HCC中铜代谢和铜死亡相关基因集显著下调，交叉队列分析鉴定出STEAP4、HAMP、MT1H和SLC46A3四个核心差异基因，其中STEAP4的ROC曲线下面积（AUC=0.924）最高，提示其作为铜稳态调控因子的诊断价值。多队列验证（GSE121248、GSE94660、TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP、CPTAC-HCC）一致证实STEAP4在HBV相关HCC中显著下调，且其表达与病理T分期呈负相关。临床标本分析（12对HBV-HCC癌与癌旁组织）显示肿瘤组织中Cu²⁺含量显著升高，而STEAP4蛋白水平显著降低。组织微阵列（TMA）和生存分析进一步证实低STEAP4表达与HBV阳性患者更差的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）相关。综上，STEAP4缺失是HBV相关HCC的显著分子特征，破坏了铜稳态并削弱了铜死亡网络。

2. 抗HBx通过上调STEAP4使HBV相关HCC细胞对ES诱导的铜死亡敏感化

在HBx转基因（HBx-Tg）小鼠中，转录组学显示STEAP4和核心铜死亡调控因子FDX1下调，GSEA证实铜代谢和铜死亡信号通路受抑制，且肝组织Cu²⁺随年龄增加而升高。HBx表达的HepG2细胞整合转录组/蛋白质组学分析同样显示STEAP4一致下调，Venn交集分析将STEAP4确定为唯一的共享候选基因。功能实验表明，HBx阳性HCC细胞系（HepG2.2.15、MHCC-97H）对ES-Cu诱导的铜死亡表现出部分耐受性。通过转染细胞内抗HBx单克隆抗体（anti-HBx mAb）中和HBx后，细胞内Cu²⁺降低而Cu⁺升高，总谷胱甘肽（T-GSH）增加，同时FDX1、LIAS、脂酰化DLAT减少，HSP70升高，DLAT寡聚体形成增加，呈现典型的铜死亡分子特征。多种细胞死亡抑制剂（氯喹、Fer-1、Nec-1、Z-VAD-FMK等）均不能挽救ES诱导的细胞死亡，而铜螯合剂TTM可完全恢复细胞活力，证实该过程为铜依赖性铜死亡。因此，靶向HBx可恢复铜死亡敏感性，STEAP4是HBx驱动铜死亡抵抗的关键节点。

3. TTM逆转STEAP4介导的ES诱导铜死亡敏感化和肿瘤抑制作用

研究团队在HepG2.2.15和MHCC-97H细胞中建立STEAP4稳定敲低和过表达（STEAP4-OE）模型。STEAP4敲低显著增加ES耐受性，而STEAP4过表达显著增强ES敏感性，且该效应可被TTM完全逆转，确立了铜依赖性机制。STEAP4-OE增加细胞内铜氧化还原通量，尤其显著促进线粒体Cu⁺积累，同时升高T-GSH水平。ES处理后，STEAP4-OE细胞表现出FDX1、DLAT、LIAS及脂酰化DLAT减少、HSP70升高的典型铜死亡标志，DLAT寡聚化和焦点形成增加，这些变化均被TTM逆转。遗传学实验显示，FDX1敲除（FDX1-KO）可部分削弱STEAP4-OE的致敏效应，而STEAP4-OE也可部分缓解FDX1-KO导致的过度敏感，提示二者存在功能交叉而非简单冗余。此外，STEAP4-OE抑制克隆形成、增强ES抗增殖活性，并上调E-cadherin、下调Vimentin，提示EMT特征减弱。综上，STEAP4通过增强线粒体铜氧化还原重塑和诱导典型铜死亡标志，以铜依赖性方式强化ES触发的铜死亡。

4. STEAP4协调线粒体代谢重编程以赋予HBx表达HCC细胞铜死亡抵抗

铜死亡优先杀伤线粒体呼吸依赖型细胞，而糖酵解偏向型细胞敏感性较低。HBx表达模型（HepG2细胞和HBx-Tg小鼠肝组织）的代谢组学分析显示糖酵解/磷酸戊糖途径（PPP）相关代谢物增加、TCA循环中间产物减少，提示代谢向糖酵解状态转变。STEAP4-OE的转录组学分析则呈现相反模式：铜代谢和铜死亡相关基因、线粒体电子传递链（ETC）复合物和TCA循环相关基因上调，糖酵解通路基因下调。GO分析显示"电子传递活性正调控"、"线粒体呼吸链"和"4铁4硫簇结合"通路激活；KEGG富集突出"氧化磷酸化"和"癌症中心碳代谢"通路。透射电镜（TEM）显示ES处理后STEAP4-OE细胞线粒体嵴破坏、肿胀和空泡化，线粒体碎片化增加。功能上，ES显著损害线粒体呼吸链复合物I-V活性，降低TCA相关代谢物、NAD⁺/NADH比值和ATP水平。Seahorse分析表明，STEAP4-OE提高基础和最大呼吸速率，但ES处理后最大呼吸和备用呼吸能力显著崩溃；同时STEAP4-OE抑制糖酵解参数。整合OCR/ECAR分析显示STEAP4-OE使细胞全局转向线粒体代谢依赖状态，这种状态对ES触发的线粒体衰竭选择性脆弱。因此，STEAP4将HBx阳性HCC细胞从糖酵解重编程为TCA循环/呼吸依赖，从而放大ES-Cu诱导的铜死亡脆弱性。

5. ES和STEAP4协同增强铜死亡敏感性并在体内抑制HBV相关HCC肿瘤发生

皮下移植瘤模型（MHCC-97H细胞，n=5/组）显示，STEAP4-OE或ES单药治疗均显著抑制肿瘤生长，二者联合产生更显著的协同抑制效应。联合治疗组肿瘤内Cu²⁺升高，TEM显示线粒体超微结构缺陷（嵴丢失、空泡化）最显著，ETC活性降低，TCA代谢物、NAD⁺/NADH比值和ATP产生减少，铜死亡和EMT标志改变最大。原位肝癌模型（HepG2.2.15-Luc细胞，n=6/组）进一步验证，ES或STEAP4-OE单药显著减少肿瘤负荷、肝内结节数和局部播散，联合治疗产生稳健的协同抗肿瘤效应。综上，STEAP4-OE通过铜死亡抑制HBV相关HCC，并与ES协同实现更优的抗肿瘤效果。

6. SIRT3介导的STEAP4去乙酰化调控其在HBx表达HCC细胞中的线粒体转位

免疫荧光和线粒体分级分离显示，anti-HBx中和HBx后STEAP4线粒体定位显著恢复。通过Co-IP/质谱分析STEAP4相互作用组，GO富集显示"糖酵解过程"、"丙酮酸代谢过程"、"线粒体"和"ATP结合"通路；PTM富集突出乙酰化相关蛋白，提示赖氨酸乙酰化调控STEAP4相互作用和亚细胞定位。烟酰胺（NAM，Sirtuin抑制剂）显著增加STEAP4乙酰化，而HDAC抑制剂TSA作用微弱，表明STEAP4去乙酰化主要由Sirtuin轴调控。IP-MS鉴定出SIRT3（线粒体去乙酰化酶）为关键候选。SIRT3激动剂honokiol（HKL）减少STEAP4乙酰化并增强SIRT3-STEAP4在线粒体组分中的结合。上游乙酰转移酶筛选将ELP3确定为STEAP4的主要生理乙酰转移酶。邻近连接分析（PLA）和共聚焦成像证实SIRT3与STEAP4空间邻近，anti-HBx显著增加STEAP4-SIRT3 PLA焦点数量。Co-IP证实anti-HBx增强STEAP4-SIRT3相互作用及其在线粒体斑点中的共定位。HBx阻断减少STEAP4乙酰化并增强STEAP4-SIRT3复合物的线粒体关联，表明HBx拮抗SIRT3依赖性去乙酰化从而破坏STEAP4线粒体输入。通过STEAP4截短/缺失突变体分析，将关键结合区域缩小至C末端395-459氨基酸残基。等温滴定量热法（ITC）直接定量证实SIRT3与STEAP4结合，缺失C末端显著降低结合亲和力。综上，HBx通过干扰ELP3/SIRT3乙酰化开关使STEAP4趋向乙酰化，破坏其线粒体转运，损害线粒体代谢稳态，最终增加铜死亡脆弱性。

7. STEAP4-K404去乙酰化启动铜死亡并在原位HCC模型中增强ES疗效

计算机模拟对接预测Lys333和Lys404为STEAP4中潜在的SIRT3相互作用残基。线粒体组分SIRT3免疫沉淀物的质谱鉴定Lys404（K404）为主要乙酰化位点，且该位点跨物种进化保守。研究团队构建了STEAP4-WT、乙酰化模拟突变体K404Q和去乙酰化模拟突变体K404R。与WT相比，K404Q表现出基础乙酰化增加、SIRT3结合减少、线粒体定位受损；K404R则呈现相反表型。功能上，K404Q削弱ES诱导的铜死亡，而K404R显著致敏HBx表达HCC细胞对ES的反应。原位肿瘤模型（HepG2.2.15-Luc，n=6/组）显示，K404Q肿瘤对ES耐药，表现为更高的生物发光信号、更大的肿瘤体积和更多的肝内结节；K404R肿瘤则对ES超敏感，肿瘤负荷显著降低。机制上，K404乙酰化状态决定肿瘤内Cu²⁺丰度和铜死亡信号：K404Q肿瘤积累更多Cu²⁺但表现为铜死亡抵抗特征（FDX1、DLAT、脂酰化DLAT和LIAS减少，HSP70升高），K404R肿瘤则呈现相反模式。组织病理学和IHC分析证实了肿瘤侵袭性和增殖活性的差异。综上，SIRT3介导的STEAP4-K404去乙酰化是功能性启动铜死亡通路和对ES产生充分治疗反应的必要且充分条件。

8. Honokiol通过SIRT3-STEAP4依赖性铜死亡发挥抗肿瘤活性

Honokiol（HKL）是一种天然SIRT3激动剂，可恢复线粒体氧化磷酸化并逆转Warburg效应。HKL处理HepG2.2.15细胞的RNA-seq显示核心铜死亡基因（PDHB、STEAP4、LIAS、LIPT1、FDX1、DLD、DLAT）显著上调，氧化磷酸化、TCA循环、线粒体电子传递链和铁硫簇通路激活。PPI网络将SIRT3-STEAP4轴定位为连接线粒体代谢与铜死亡调控的中心节点。shRNA介导的STEAP4敲低（shSTEAP4）消除了HKL诱导的SIRT3-STEAP4邻近PLA焦点增加和线粒体STEAP4转位。TEM显示HKL增加线粒体质量和嵴完整性，这些益处被STEAP4敲低逆转。Seahorse分析表明HKL增强基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力，而shSTEAP4细胞无反应；HKL抑制基础糖酵解和糖酵解储备也依赖STEAP4。HKL联合ES显著增强HBx表达HCC细胞的铜死亡，该效应被STEAP4敲低显著削弱。HKL还抑制克隆存活和EdU掺入，增强ES抗增殖活性，上调E-cadherin、下调Vimentin。原位肝癌模型中，HKL+ES联合方案比ES单药产生显著更强的抗肿瘤效果，表现为更低的生物发光信号和减弱的肿瘤进展。机制上，联合治疗升高肿瘤内Cu²⁺并诱导铜死亡对齐的蛋白特征，伴随HSP70诱导；STEAP4基因敲除逆转这些效应。综上，HKL通过SIRT3-STEAP4轴重编程线粒体生物能量学，增强ES触发的铜死亡，是恢复HBV相关HCC线粒体脆弱性的合理代谢辅助策略。

三、研究结论

本研究首次揭示HBx通过破坏线粒体SIRT3-STEAP4轴赋予HBV相关HCC铜死亡抵抗的分子机制。主要结论如下：

HBx-SIRT3-STEAP4调控轴：HBx抑制SIRT3表达，损害STEAP4在Lys404位点的去乙酰化，阻止其线粒体定位，导致细胞从TCA循环呼吸转向糖酵解，降低对铜离子载体ES的敏感性。

STEAP4的代谢调控作用：STEAP4是HBV相关HCC中铜代谢和铜死亡敏感性的关键调控因子，其表达与患者预后密切相关。恢复STEAP4表达可将肿瘤细胞代谢从糖酵解重编程为氧化磷酸化/TCA循环依赖，从而放大铜死亡脆弱性。

治疗策略：STEAP4过表达与ES联合在体内外产生协同抗肿瘤效应；SIRT3天然激动剂Honokiol（HKL）通过恢复STEAP4线粒体定位增强ES疗效，为HBV相关HCC的铜死亡导向联合治疗提供了临床前依据。

PTM调控新机制：首次证明SIRT3直接去乙酰化STEAP4的K404位点是调控其线粒体转位和铜死亡功能的关键开关，揭示了一种新的病毒利用翻译后修饰逃逸内在细胞死亡程序的策略。

Du ZB, Wu XM, Lei JM, Cai YX, He J, Qian B, He XX, Han WH, Lu Y, Xia XG, Zheng HY, Guo DB, Yao YL, Li WG, Lin YC, Lin ZN. SIRT3 deacetylates STEAP4 to modulate cuproptosis sensitivity via mitochondrial metabolic reprogramming in HBV-related HCC. Cell Death Differ. 2026 Mar 16. doi: 10.1038/s41418-026-01713-w. Epub ahead of print. PMID: 41840161.