环境污染物乙酰三丁基柠檬酸酯诱导口腔鳞状细胞癌的机制：网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟研究

【研究背景】

随着工业化学的迅速发展，新型环境污染物对人类健康和生态系统的影响日益显著。塑料制品因其轻便、耐用和低成本的特性被广泛应用于各行各业，但塑料增塑剂的潜在健康危害逐渐受到关注。乙酰三丁基柠檬酸酯（ATBC）作为一种新兴的增塑剂，在塑料制造业中占据重要地位，尤其是在获得欧盟批准用于食品接触材料后，其使用更加广泛。然而，越来越多的证据表明ATBC可能通过内分泌干扰和代谢改变等机制对健康造成威胁，且其信号通路与癌症的发生和发展相关。鉴于此，本研究旨在探讨ATBC与口腔鳞状细胞癌（OSCC）之间的关联，以期为评估环境健康风险提供科学依据，并为制定相关防护策略奠定基础。

【研究方法】

研究整合了网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟等多种方法。首先，通过ProTox-3.0、ADMETlab 3.0和ChemBlink数据库对ATBC进行毒性分析，并从PubChem数据库获取ATBC的SMILES序列。随后，利用Swiss Target Prediction、ChEMBL和TargetNet数据库以及STITCH数据库预测ATBC的潜在靶标，并通过UniProt数据库标准化靶标名称，构建ATBC的靶标库。同时，从GeneCards、OMIM和TTD数据库收集OSCC相关靶标，通过Venn网站确定化合物靶标与疾病靶标的重叠部分，作为ATBC诱导OSCC的潜在靶标。接下来，利用STRING12.0数据库和Cytoscape3.9.1软件构建蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过CytoNCA插件筛选核心靶标。使用DAVID数据库对交集靶标进行GO和KEGG通路富集分析。此外，从NCBI中GEO数据库获取GSE74530数据集，识别OSCC组织与正常对照组织之间的差异表达基因（DEGs），并与ATBC相关靶标进行交集分析。最后，利用AutoDock Vina进行分子对接实验，模拟ATBC与核心靶标的结合模式，并使用Gromacs软件对蛋白-ATBC复合物进行分子动力学模拟，以评估结合的稳定性和可靠性。

【研究结果】

n 毒理学分析

通过ProTox-3.0、ADMETlab3.0和ChemBlink数据库对ATBC进行毒理学评估，结果表明ATBC具有致癌性，且对皮肤和眼睛有显著的刺激潜力，但对内脏器官的毒性不明显。

n ATBC诱导OSCC的潜在靶标识别

从GeneCards、OMIM和TTD数据库共收集到2018个潜在的OSCC相关靶标，同时从ChEMBL、TargetNet、Swiss Target Prediction和STITCH数据库以及相关文献中确定了445个ATBC相关靶标。通过Venn图分析，发现107个共同靶基因，这些基因可能在ATBC与OSCC的相互作用中发挥关键作用。

n PPI网络构建与核心靶标筛选

基于STRING数据库构建的PPI网络包含106个节点和1483条边。利用CytoNCA插件进一步分析网络节点的拓扑特征，筛选出22个核心靶标，包括AKT1、MMP2、BRAF、HSP90AA1、CASP8、SIRT1、MAPK14、GSK3B、AR、CREBBP、MAPK1、ESR1、CASP3、BCL2、PPARG、MMP9、EGFR、ERBB2、MAPK3、PARP1、MDM2和NR3C1，这些蛋白在多种生物过程中发挥着重要作用，可能是ATBC诱导OSCC分子机制的关键调控因子。

n GO和KEGG通路富集分析

对107个潜在靶标进行GO富集分析，发现ATBC诱导的OSCC主要涉及蛋白磷酸化、RNA聚合酶II转录的正调控、细胞群体增殖的正调控、凋亡过程的负调控、基因表达调控和信号转导等生物过程，以及细胞质、核质、受体复合体、细胞核、染色质和含蛋白复合体等细胞组分，同时还与核受体活性、蛋白结合、ATP结合和肽酶活性等分子功能密切相关。KEGG通路分析显示，这些靶标与癌症信号通路、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活以及PI3K-Akt信号通路等153条不同通路相关，表明ATBC对细胞信号网络的广泛影响。

n OSCC中的DEGs鉴定

对GSE74530数据集分析发现，与健康对照相比，OSCC患者中有1820个上调基因和685个下调基因。通过Venn分析，发现ATBC靶基因与GSE74530数据集中的DEGs之间存在50个重叠基因，其中MMP9、AR、MAPK3、MMP2、PARP1和ERBB2等基因在ATBC诱导的致癌机制中具有关键作用。

n 分子对接验证

对ATBC与基于度中心性排名前八的核心靶标（AKT1、HSP90AA1、ESR1、CASP3、BCL2、PPARG、MMP9和EGFR）进行分子对接分析，结果显示这些核心蛋白均与ATBC具有较高的结合亲和力，结合能分别为：MMP9（−7.1 kcal/mol）、HSP90AA1（−6.4 kcal/mol）、BCL2（−6.3 kcal/mol）、EGFR（−6.3 kcal/mol）、AKT1（−6.1 kcal/mol）、PPARG（−5.3 kcal/mol）、ESR1（−5.2 kcal/mol）和CASP3（−5.1 kcal/mol）。

n 蛋白-配体复合物的分子动力学模拟

对EGFR-ATBC、HSP90AA1-ATBC和MMP9-ATBC复合物进行分子动力学模拟，结果显示三个复合物均达到平衡状态，其中HSP90AA1-ATBC复合物最为稳定。RMSD值显示蛋白复合物的RMSD一般在0.1-0.3nm之间，配体的RMSD在0.02-0.1nm之间，表明复合物内结合紧密。RMSF分析显示MMP9-ATBC和HSP90AA1-ATBC复合物整体波动较小，RMSF值保持在1 nm以内，而EGFR-ATBC复合物在大约750、870和1100位残基处出现明显峰值，提示这些区域的灵活性增加，可能有助于配体相互作用，促进功能发挥。氢键数量变化分析表明，在三次独立的分子动力学模拟中，配体与三种蛋白之间形成的氢键数量在0-2个之间，其中MMP9与ATBC形成氢键的频率高于其他两种蛋白，暗示MMP9可能与ATBC形成更强或更稳定的相互作用。吉布斯自由能景观分析进一步揭示了配体-受体相互作用的能量特性和构象变化路径，低能量的构象状态主要集中在蓝色和绿色区域，代表稳定构象，而红色区域对应高能量状态。ATBC与三个蛋白受体结合时，相应的PC1值在0.0-0.3之间，与复合物的RMSD曲线相结合，进一步证实了ATBC-蛋白质受体结合的高稳定性。结合自由能计算结果显示，ATBC-EGFR复合物的结合自由能最低（−43.46 kcal/mol），其次是ATBC-HSP90AA1（−38.80 kcal/mol）和ATBC-MMP9（−35.50 kcal/mol），且总结合自由能为负值，表明ATBC与大分子的结合在热力学上是有利的，疏水效应和静电相互作用是主要的驱动力。

【研究结论】

本研究通过结合网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟，为理解ATBC可能如何促进OSCC的发展提供了机制上的认识。研究揭示了ATBC的多方面生物相互作用，并确定了可能驱动致癌过程的关键分子靶标和通路。这些发现不仅加深了我们对ATBC毒理学特征的理解，还为环境风险评估提供了关键证据，特别是在塑料增塑剂的广泛应用方面。未来的研究应探讨塑料增塑剂暴露与其他口腔病理学之间的关联，如口腔白斑和口腔黏膜下纤维化，以增强对塑料增塑剂相关健康风险的全面评估，并指导政策决策，朝着更安全的环境方向发展。

Guo Y, Liu Y, Chen Y, Du S, Zheng Y, Wang L. The mechanisms of environmental pollutant acetyl tributyl citrate induced oral squamous cell carcinoma using network toxicology, molecular docking and molecular dynamics simulation. Int J Surg. 2025 Jul 24. doi: 10.1097/JS9.0000000000002967. Epub ahead of print. PMID: 40705527.